摘    要

斑马鱼是一种新兴的重要模式动物之一，具有体外受精、胚胎透明等优点。再者斑马鱼体型小，适合高通量研究，并且还具有生长繁殖周期及其与人类高度相似的基因组等优点。此外，斑马鱼还被应用于毒理学、发育生物学和遗传学等的研究。本课题利用吗啉代寡核苷酸技术建立下调斑马鱼Zmiz1b基因的技术方法,在斑马鱼Zmiz1b基因中选择适合实验的靶位点，设计针对斑马鱼Zmiz1b基因的吗啉代寡核苷酸序列,并通过显微注射的方式注射到斑马鱼胚胎中。研究当Zmiz1b基因沉默后，观察斑马鱼表型变化的观察（包括致死率以及致畸率）。从而获取吗啉代寡核苷酸技术建立下调斑马鱼Zmiz1b基因对斑马鱼表型影响的研究。

 

关键词：斑马鱼； 吗啉代寡核苷酸技术； Zmiz1b基因；显微注射技术；PCR技术

目录

1.引 言 5

1.1背景介绍 5

1.1.1选择斑马鱼为研究对象的背景意义 5

1.2 Zmiz1b基因简介 5

1.2.1  Zmiz1的结构 5

1.2.2  Zmiz1基因的表达与功能 5

1.3显微注射方法简介 6

1.4 基因下调方法及原理 6

1.5 本研究的目的和意义 7

2.实验材料与设备 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 实验动物 7

2.1.2实验试剂 7

2.2 主要仪器设备 7

3.实验方法 7

3.1斑马鱼特性 8

3.1.1斑马鱼的特点 8

3.1.2斑马鱼作为模式生物的特点[7] 8

3.1.3斑马鱼的养殖条件 8

3.1.4 斑马鱼繁殖过程 9

3.2总RNA的提取与纯化 10

3.2.1总RNA的提取 11

3.3 cDNA的获取 11

表3-2逆转录体系 11

3.4 用PCR方法扩增Zmiz1b基因编码的基因 12

3.4.1 引物的设计与合成 12

表3-2Zmiz1b基因的特异性引物 12

3.4.2 PCR扩增斑马鱼Zmiz1b基因 12

图3-3  PCR过程 12

表3-3 PCR反应体系 13

3.4.3 Zmiz1b morphlino 反义寡聚核苷酸的设计 13

3.5 显微注射 13

3.5.1注射前准备：斑马鱼胚胎的收集 13

3.5.2关于显微注射系统的搭建（图3-4） 13

图3-4 斑马鱼显微注射的显微操作设备 14

A: 拉针仪; B: 显微注射器; C: 持针器和显微操纵器; D：体视显微镜 14

3.5.3显微注射步骤 14

表3-4显微注射体系 14

第一步：注射所用胚胎的准备 14

第二步：显微注射仪器的准备工作 14

图3-5 全套搭建好的显微注射设备（左侧）和破针操作（右侧） 15

第三步：注射混合体系至斑马鱼胚胎中 15

图3-6 显微注射过程图 16

4.实验结果与分析 16

4.1 抑制Zmiz1b基因的表达 16

4.1.1 morphlino有效性的判断 16

图4-1 琼脂糖凝胶电泳结果 17

4.1.2 MO抑制Zmiz1b的表达对于斑马鱼胚胎发育的影响 17

5.讨论 20

参考文献 22

致 谢 23