摘    要

本研究中，我们将GmPTF7编码序列分别构入亚细胞定位和染色质免疫共沉淀载体，为分析GmPTF7蛋白的生理功能奠定基础。GmPTF7是前期利用蛋白组学筛选出的大豆耐盐响应相关的转录因子，其亚细胞定位及其作用机制等信息均不明确。我们首先以中黄57大豆根为材料，构建了cDNA文库，并通过PCR从中扩增出目的基因 GmPTF7。接着，我们将PCR产物连入 T 载体。测序正确后，我们利用限制性内切酶 Mlu Ι 和 Kpn I 将GmPTF7基因编码框插入表达载体 pDL28-35S-RFP 和 pDL28-35S-DHA-UbqDsRed 的35S启动子下游多克隆位点。然后，我们将酶切验证正确的两个植物表达载体pDL28-35S-GmPTF7-RFP 和 pDL28-35S-GmPTF7-DHA-UbqDsRed分别转化发根农杆菌K599中。最后，我们将K599菌内质粒进一步酶切验证，将确证无误的菌种保存于-80 ℃冰箱中。该实验是为后续分析GmPTF7的亚细胞定位、寻找其下游靶基因等相关研究奠定基础。

目    录

1. 引言 6

1.1. 植物对盐胁迫的响应 6

1.2. 植物盐胁迫的研究进展 7

1.3. bHLH 转录因子的结构和功能 7

1.3.1. bHLH 转录因子的结构 7

1.3.2. bHLH转录因子的功能 8

1.4. 载体构建 9

1.4.1. 表达载体载体 9

1.4.2. 载体构建过程 10

2. 材料与试剂 10

2.1. 植物材料 10

2.2. 菌株和质粒 10

2.2.1. 菌株 10

2.2.2. 质粒载体 10

2.3. 实验试剂 11

2.3.1. 酶和引物 11

2.3.2. 试剂盒 11

2.3.3. 化学试剂 11

2.4. 实验器材 11

2.5. 配方 12

2.5.1. 培养基 12

2.5.2. 缓冲液 12

3. 研究方法 12

3.1. 大豆萌发 12

3.2. 含目的基因PTF7的T载体构建 13

3.2.1. 大豆总RNA 的提取（参照康为世纪 RNApure Plant Kit说明书） 13

3.2.2. 总RNA反转录成cDNA 14

3.2.3. 目的基因PTF7扩增 15

3.2.4. 目的基因PTF7 DNA片段回收 15

3.2.5. 基因片段PTF7和T载体连接 16

3.3. 大豆基因PTF7的增殖克隆 16

3.3.1. T-PTF7转化Trans-1感受态细胞 16

3.3.2. 重组子筛选 17

3.4. 表达载体的构建 17

3.4.1. 质粒DNA的提取 17

3.4.2. 酶切并得到胶回收产物 18

3.4.3 构建重组质粒 18

3.4.4. 大肠杆菌转化 19

3.4.5 将目的基因用农杆菌转化法转入K599农杆菌 19

4. 结果与分析 20

4.1. 大豆总RNA琼脂糖凝胶图 20

4.2. 目的基因PTF7 cDNA扩增图 20

4.3. T-PTF7和两个表达载体酶切图 21

4.4. 大豆根中PTF7基因序列连接载体后菌液PCR检测图 21

4.5. 亚细胞定位表达载体和染色质免疫共沉淀实验表达载体酶切验证图 22

4.6. 转化K599挑取单克隆后PCR图 22

4.7. 提取K599中的质粒，酶切验证图 23

5. 结论与展望 23