摘    要

本研究中，我们将GmPTF4编码序列分别构入亚细胞定位和染色质免疫共沉淀载体，为分析GmPTF4蛋白的生理功能奠定基础。GmPTF4是前期利用蛋白组学筛选出的大豆耐盐响应相关的bHLH类转录因子，其亚细胞定位及其作用机制等信息均不明确。我们首先以中黄57大豆根为材料，构建了cDNA文库，并通过PCR从中扩增出目的基因 GmPTF4。接着，我们将PCR产物连入 T 载体。测序正确后，我们利用限制性内切酶 Mlu Ι 和 Kpn I 将GmPTF4基因编码框插入表达载体 pDL28-35S-RFP 和 pDL28-35S-DHA-UbqDsRed 的35S启动子下游多克隆位点。然后，我们将酶切验证正确的两个植物表达载体pDL28-35S-GmPTF4-RFP 和 pDL28-35S-GmPTF4-DHA-UbqDsRed分别转化发根农杆菌K599中。最后，我们将K599菌内质粒进一步酶切验证，将确证无误的菌种保存于-80 ℃冰箱中。该实验是为后续分析GmPTF4的亚细胞定位、寻找其下游靶基因等相关研究奠定基础。

目录

1 引言 4

1.1  bHLH 转录因子的结构和功能 5

1.2 载体构建 6

1.2.1 载体种类 6

1.2.2 载体构建过程 7

2 材料与试剂 7

2.1 植物材料 7

2.2菌株和质粒 7

2.2.1 菌株 7

2.2.2 质粒载体 8

2.3 实验试剂 8

2.3.1 酶和引物 8

2.3.2 试剂盒 8

2.3.3 化学试剂 8

2.4实验器材 8

2.5配方 9

2.5.1 培养基 9

2.5.2 缓冲液 9

3 研究方法 9

3.1 大豆萌发 9

3.2 含目的基因PTF4的T载体构建 10

3.2.1   大豆总RNA 的提取 10

3.2.2   总RNA反转录成cDNA 11

3.2.3   目的基因PTF4扩增 12

3.2.4 目的基因PTF4 DNA片段回收 12

3.2.5 基因片段PTF4和T载体连接 13

3.3大豆基因PTF4的增殖克隆 13

3.3.1 T-PTF4转化Trans-1感受态细胞 13

3.3.2 重组子筛选 14

3.4表达载体的构建 14

3.4.1 质粒DNA的提取 14

3.4.2 酶切并得到胶回收产物 15

3.4.3 构建重组质粒 15

3.4.4 大肠杆菌转化 16

4 结果与分析 16

4.1 大豆基因PTF4克隆结果 16

4.2 含基因PTF4真核表达载体构建结果 16

4.2.1 T-PTF4和T4-PTF4载体双酶切结果 16

4.2.2菌液PCR验证重组质粒T4-PTF4结果 17

4.2.3 酶切验证重组质粒T4-PTF4结果 18

5 结论与展望 18

参考文献 20

致谢 21