摘    要

 

天目铁木（Ostrya rehderiana Chun）是桦木科铁木属植物，为浙江天目山特有树种。当地现存野生成年植株5株，但其中仅有1个稳定结种，其余四株育性极低，濒临灭绝。在我们前期的实验中，对不同育性野生个体的雌花序进行了转录组表达差异分析，发现了一个与育性正相关的基因OrHMT，表明这个基因很可能参与影响了该物种育性，但其具体功能未见报道。本研究拟分析和克隆这个天目铁木OrHMT基因，构建植物表达载体并导入农杆菌，以期进一步遗传转化模式植物，获取转基因植株，探究该基因如何影响植株育性，探索其潜在功能，为天目铁木的致濒机制提供理论依据。

 

关键词：天目铁木；育性；OrHMT基因；克隆；致濒机制

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1 引言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 主要试剂和仪器

2.3 基因克隆

2.3.1 天目铁木雌花序Total RNA的提取

2.3.2 RNA反转录合成cDNA

2.3.3 以cDNA为模板进行RT-PCR扩增

2.3.4 PCR产物回收

2.3.5 PCR产物和T载体的连接

2.3.6 连接产物转化进入感受态细胞

2.3.7 菌落PCR的鉴定

2.3.8 摇菌以及菌种保存

2.3.9 大肠杆菌内质粒DNA的提取

2.3.10 克隆载体的酶切验证

2.4 构建过表达载体

2.4.1 克隆载体及表达载体的酶切

2.4.2 目的片段与载体片段的连接

2.5 表达及干涉载体转化农杆菌

2.5.1 制备农杆菌感受态细胞（CaCl2法）

2.5.2 质粒转化农杆菌(冻融法)

2.5.3 农杆菌摇菌以及菌种保存

3 实验结果

3.1 天目铁木育性相关基因OrHMT的克隆

3.1.1 天目铁木OrHMT基因特异性PCR扩增

3.1.2 克隆载体菌落PCR验证

3.1.3 克隆载体酶切验证图

3.2 天目铁木OrHMT基因植物表达载体构建

3.2.1 表达载体菌落PCR验证（未带阴性对照）

3.2.2 表达载体酶切验证

3.2.3 农杆菌菌落PCR验证

4 讨论

5 总结

参考文献

致谢