摘    要

灵芝：又称林中灵、琼珍,是一种食用兼药用真菌，是我国一种传统名贵中药材。近二十年来国内外的大量研究结果表明，灵芝富含糖类、麦角甾醇、三萜类等活性成分，具有广泛的药理作用，对调节免疫、抑制肿癌、解毒、保肝护肝和促进睡眠等方面均具有显著疗效。野生灵芝量较少，目前主要以人工栽培为主，而人工栽培过程中种性的稳定是灵芝产业发展的基础。通过对灵芝SSR分子标记的开发以及应用与灵芝育种家系品种的纯度鉴定中，对灵芝育种家系遗传稳定性的研究，以及灵芝产业均具有重要的意义。我们的实验结果表明：在灵芝的传代过程中，SSR标记8这段140 bp的DNA序列中，第一次、第二次和第三次传代过程中发生碱基突变的概率分别为37.5%，25%和60%。有较明显的上升趋势，且主要发生突变的菌种围绕在2016年传代的菌种之间。可见随着传代次数与传代年份的增加，灵芝菌种发生突变的频率越来越高；且主要的已发生突变的围绕在腺苷酸（A）与胸腺嘧啶（T）。

目录

1. 引言 7

1.1 灵芝简介 7

1.2 国内外研究现状综述 7

1.3 研究方法及技术路线 8

（1） 收集灵芝育种家系； 8

（2） 灵芝基因组文库的构建； 8

（3） 将构建的基因组文库进行PCR扩增； 8

（4） 对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳； 8

（5） 回收所需的DNA片段； 8

（6） TA克隆测序； 8

（7） 实验结论以及分析。 8

1.4 SSR分子标记技术概况 8

1.4.1 SSR分子标记技术的原理 8

1.4.2 SSR分子标记技术的应用及研究成果 8

1.4.3 SSR分子标记技术的优点 9

1.5 研究意义 9

2. 材料与方法 9

2.1 实验材料 9

2.2 实验步骤 10

2.2.1 灵芝基因组DNA提取与灵芝DNA浓度检测 10

2.2.2 SSR分子标记引物筛选 11

2.2.3 PCR扩增体系以及反应程序 15

2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳 16

2.2.5 银染和显影的步骤 16

2.2.5 回收DNA片段 17

2.2.6 TA克隆 18

3. 结果与分析 18

3.1 灵芝SSR分子标记引物筛选 18

3.2 灵芝SSR分子标记的电泳结果 19

3.3 灵芝目的DNA片段的测序结果 19

3.3.1 目的DNA核苷酸序列 19

3.3.2 序列比对结果 24

4. 讨论与展望 26

4.1讨论 26

4.2展望 27

参考文献 28

致谢 28

表2-1 灵芝家系表 10

表2-2 灵芝50对SSR引物表 11

表2-3 PCR扩增体系表 15

图3-1 部分引物筛选情况图 19

图3-2 SSR-8号引物家系扩增图 19

图3-3 序列对比图 25

表3-1 菌种DNA碱基突变表 25

表3-2 传代年份与突变频率表 25