摘  要

bZIP (basic leucine zipper）是植物最大的转录因子家族之一，广泛参与植物生长发育的调控。GmBZIP131是我们前期通过蛋白组学分析找到的，与大豆耐盐响应相关的bZIP类转录因子，但是其作用机制及亚细胞定位等信息均不明确。我们以中黄57号大豆根为材料，提取RNA反转录成cDNA，并通过PCR从中扩增出目的基因 GmBZIP131。然后将PCR产物连入pEASY克隆载体。测序正确后，分别利用限制性内切酶Kpn Ι和Sac I将GmBZIP131基因编码的序列插入 pDL28-35S-RFP亚细胞定位表达载体；利用Kpn Ι酶将GmBZIP131基因编码框插入pDL28-35S-DHA-UbqDsRed染色质免疫共沉淀表达载体的启动子下游序列中。得到酶切验证正确的两个植物表达载体。接着分别将这两种载体转化发根农杆菌K599中。最后，我们将K599农杆菌体内的质粒进一步酶切验证，将验证结果正确的菌种保存于-20 ℃和-80 ℃冰箱中各保存一管。本论文中涉及的实验是为后续分析GmBZIP131的亚细胞定位、为进一步研究GmBZIP131蛋白的功能鉴定提供参考依据。

目   录

引言 7

1.研究背景 7

2.bZIP转录因子 7

3.大豆的遗传转化 7

4.载体的构建 8

一、实验材料与试剂 9

1.1植物材料 9

1.2菌种与载体 9

1.3试剂（酶） 9

1.4试剂盒 9

1.5实验仪器 9

1.6培养基和缓冲液 9

二、实验方法 10

2.1大豆GmbZIP131的引物设计 10

2.2基因GmbZIP131的克隆 10

2.2.1 大豆总RNA的提取 10

2.2.2 大豆cDNA反转录 11

2.2.3大豆目的基因全长的克隆 12

2.2.4回收目的基因DNA片段 13

2.2.5  T载体连接 14

2.3大豆目的基因的增殖克隆 14

2.3.1 T连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 14

2.3.2重组子筛选 14

2.4 表达载体的构建 14

2.4.1连接片段的获得 14

2.4.2构建重组质粒 15

2.5将目的基因转入K599农杆菌 16

三、实验结果 17

3.1大豆总RNA的电泳图 17

3.2目的基因cDNA的扩增图 17

图3-2从cDNA中扩增目的基因序列的电泳图 17

3.3 T-GmBZIP131与表达载体的酶切分析图 17

图3-3目的基因和载体酶切的结果图 18

3.4目的基因表达载体的菌液PCR验证图 18

图3-4 菌落PCR鉴定 18

3.5目的基因表达载体的酶切验证图 19

图3-5重组子的单、双酶切鉴定 19

3.6转入K599农杆菌后的PCR验证图 19

图3-6 K599转化后的PCR结果图 19

3.7 K599中质粒的酶切验证图 19

图3-7K599转化后的酶切结果图 20

讨论 20

参考文献 20

致谢 2