摘 要

 

为构建NbRCD1蛋白的酵母双杂交的诱饵载体，本研究以烟草基因组RNA为模板，通过反转录成cDNA，利用PCR方法扩增得到烟草NbRCD1基因的编码序列,经一步法克隆构建pGBKT7 -NbRCD1诱饵质粒，质粒转化大肠杆菌trans1-T1感受态后经Kana抗性筛选、双酶切、PCR 检测及测序验证其正确后。结果显示，诱饵质粒pGBKT7-NbRCD1插入片段大小为1740bp，且未发生基因突变。综上表明，我们正确构建了NbRCD1基因酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-NbRCD1，这为进一步利用酵母双杂交技术筛选与NbRCD1互作的宿主蛋白，以及进一步探究这些蛋白的功能及分子机制奠定了基础。

 

关键词：烟草； NbRCD1； 载体构建；pGBKT7（BD）；酵母双杂交

目   录

 

引言 4

1 研究目的 5

2 材料与方法 5

2.1质粒与细胞 5

2.2试剂和仪器 5

2.3 烟草NbRCD1基因扩增 5

2.3.1 植物基因组RNA提取 5

2.3.2 烟草cDNA基因组逆转录获得 6

2.3.3 烟草cDNA基因扩增 7

2.3.4 烟草NbRCD1基因溶胶回收 8

2.4  双酶切反应 9

2.4.1 烟草NbRCD1基因、BD（pGBKT7）载体双酶切 9

2.4.2 琼脂糖凝胶电泳检测 9

2.5 BD（pGBKT7）-NbRCD1诱导载体的构建 10

2.5.1 BD（pGBKT7）载体与NbRCD1基因连接 10

2.5.2 BD(pGBKT7)-NbRCD1重组质粒转化 10

2.5.3 大肠杆菌扩增培养 11

2.5.4 大肠杆菌菌液PCR验证 11

2.6 BD(pGBKT7)-NbRCD1重组质粒提取 11

2.7 BD(pGBKT7)-NbRCD1重组质粒酶切验证 12

2.8 BD(pGBKT7)-NbRCD1重组质粒测序检验菌株保藏 12

3 结果 12

4 结论 13

5讨论 14

参考文献 15

致谢 16