摘    要

酶发酵技术由于其高效、绿色、环保等特点被广泛应用于制药和食品等工业。(S)-2,2’,4’-三氯苯乙醇((S)-TCPE)是制备一种抗真菌药卢立康唑的中间体，本研究先对本实验室筛选得到了一种能够催化2,2’,4’-三氯苯乙酮(TCAP)生成(S)-TCPE的醛酮还原酶(TM1743)进行半理性改造，筛选出ee值高达99.99%的突变体TM1743-A94S；接着探索TM1743-A94S的最佳反应条件，结果其反应最佳温度为30℃，最佳PH为6.5，为该酶的进一步应用提供依据。

目录

摘    要 I

Abstract I

1 引言 1

1.1酶制剂简介 1

1.2手性醇化合物简介及制备意义 1

1.3醛酮还原酶的研究现状及产业化面临问题 2

1.4蛋白质定向进化研究进展 3

1.4.1突变方法 3

1.4.2工程酶的突变体筛选手段 4

1.5本实验研究基础及内容 4

2. 实验材料与方法 6

2.1 分子对接和分子模拟 6

2.2蛋白表达与纯化 6

2.3突变体筛选 6

2.3.1 TM1743突变库的构建与筛选 6

2.3.2 TM1743联合突变酶筛选 7

2.3.3 醛酮还原酶TM1743的定点饱和突变、表达及筛选 7

2.4 最佳突变体的最适反应条件及动力学性质测定 9

2.4.1最佳突变体的酶动力学常数测定 9

2.4.2 最佳突变体催化底物的最适温度及温度稳定性 9

2.4.3 最佳突变体催化底物的最适pH及pH稳定性 10

2.5蛋白纯化及定量 10

2.5.1蛋白纯化及脱盐 10

2.5.2纯化蛋白脱盐处理 11

2.5.3蛋白浓度标准曲线绘制及定量 11

3. 实验结果 11

3.1 pET-28a-TM1743双酶切验证 11

3.2 TM-NADPH-TCAP复合物结构及动力学性质 12

3.3 TM1743突变结果筛选 13

3.4 各位点的最佳突变体的酶动力学常数测定 13

3.5 最佳突变体催化底物的最适温度及温度稳定性 14

3.6 最佳突变体催化最适PH 14

3.7 蛋白纯化及蛋白浓度测定 15

4. 讨论 16

4.1 醛酮还原酶TM1743异源表达 16

4.2 TM-NADPH-TCAP复合物结构性质 16

4.3 TM1743突变筛选结果 16

4.4 最佳突变体最适反应及其稳定性 17

4.5总结 17

参考文献 18

致谢 20