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摘 要
本研究是将GmWRKY24编码序列分别构入亚细胞定位和免疫共沉淀载体，为研究GmWRKY24基因在盐胁迫下的功能奠定基础。GmWRKY24是前期利用蛋白质组学筛选出的大豆耐盐响应相关的WRKY类转录因子。本实验以中黄25大豆为材料，构建出cDNA文库。从大豆根的cDNA文库中克隆所需的目的基因GmWRKY24序列。将它与T-vector连接成为重组子。测序正确后，通过限制性内切酶Kpn I和Sac I双酶切将测序正确的GmWRKY24从T载体上切下来，连入植物表达载体pDL28-35S pro-RFP。通过限制性内切酶Kpn I单酶切将测序正确的GmWRKY24从T载体上切下来，连入植物表达载体pDL28-35S pro-DHA-UbqDsRed。得到的两个连接产物分别为pDL28-35S pro-GmWRKY24-RFP 和 pDL28-35S pro-GmWRKY24-DHA-UbqDsRed，进行酶切验证，验证正确后将菌种于-80℃冰箱保存。
关键词：大豆；WRKY转录因子；载体构建
目 录
引言.....................................................................................................................................................5
1.1盐胁迫对植物的影响...............................................................................................................5
1.2 WRKY转录因子的结构和功能..............................................................................................5
1.3载体构建技术...........................................................................................................................6
1.3.1载体类型............................................................................................................................7
1.3.2载体构建过程....................................................................................................................7
2.材料与试剂......................................................................................................................................8
2.1植物材料...............................................................................................................................8
2.2质粒和菌株...........................................................................................................................8
2.3实验试剂...............................................................................................................................8
2.3.1化学试剂........................................................................................................................8
2.3.2酶和引物........................................................................................................................8
2.4配方.......................................................................................................................................8
2.4.1缓冲液............................................................................................................................8
2.4.2 培养基...........................................................................................................................8
2.5 实验器材..............................................................................................................................8
3.研究方法..........................................................................................................................................8
3.1大豆萌发...............................................................................................................................8
3.2含目的基因GmWRKY24的T载体构建...........................................................................9
3.2.1大豆GmWRKY24基因全长的克隆............................................................................9
3.3 目的基因GmWRKY24 DNA片段回收...........................................................................11
3.3.1胶回收...........................................................................................................................11
3.3.2 基因片段GmWRKY24和T载体连接.....................................................................12
3.4大豆基因GmWRKY24的增殖克隆..................................................................................12
3.4.1 T连接产物T-WRKY24转化大肠杆菌感受态细胞..................................................12
3.4.2重组子筛选...................................................................................................................12
3.5表达载体的构建..................................................................................................................12
3.5.1质粒DNA的提取........................................................................................................12
3.5.2 酶切并得到胶回收产物..............................................................................................13
3.5.3构建重组质粒...............................................................................................................13
3.5.4大肠杆菌转化...............................................................................................................14
3.5.5将目的基因用农杆菌转化法转入K599农杆菌........................................................14
4.结果与分析.................................................................................................................................15
4.1大豆总RNA琼脂糖凝胶图...............................................................................................15
4.2目的基因逆转录成cDNA并扩增的琼脂糖凝胶图.........................................................15
4.3 T-WRKY24、表达载体pDL28-35S pro-RFP 和pDL28-35S pro-DHA-
UbqDsRed酶切图.....................................................................................................................16
4.4 pDL28-35S pro-GmWRKY24-RFP和pDL28-35S pro-GmWRKY24-DHA-UbqDsRed
酶切验证图...............................................................................................................................16
5.讨论..............................................................................................................................................17
6.参考文献.....................................................................................................................................20
7.致谢..............................................................................................................................................21
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