摘    要

    (R)-2- 羟基 -4- 苯基丁酸乙酯(R-HPBE)是一种关键中间体，能够用于合成普利类药品。普利类药品能够治疗心血管疾病，具有众多优点如疗效显著、不良反应小、作用时间长等，有较大的市场需求，因此高效合成R-HPBE具有实际意义。R-HPBE的合成法主要包括生物法和化学法，其中利用酮还原酶直接对底物EOPB进行不对称还原，是最有的潜力方法之一。

酮还原酶是指能将不同类型的含羰基物质催化还原为手性醇的一类酶，一般都有极高的选择性（包括化学、区域和立体）。酮还原酶催化底物EOPB还原时，往往会生成(S)构型副产物。基于此，本实验需要在酮还原酶酶库基础上，克隆表达更多的酶种，对酶库进行丰富并扩大，并且以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯（EOPB)为底物，筛选出对EOPB还原具有高活性、高选择性(R型产物高ee值）和较高稳定性的酮还原酶。

首先，本实验构建了15种酮还原酶基因的表达载体，并分别测定了底物谱，扩大了酶库；然后在对酮还原酶酶库的各种酶进行基因诱导表达的基础上，将EOPB作为底物检测了各种酮还原酶的活力以及手性选择性。

结果显示，其中的9个酮还原酶对EOPB都表现出了很好的催化活性；但是就反应的对映体选择性来说，KE1是最好的；对KE1进行酶学性质探究，其最适PH是6.5，最适温度为50℃。

 

关键词：酮还原酶；立体选择性；不对称还原；R-HPBE；ee值

目    录

1 前言 1

1.1 手性化合物制备的研究现状 1

1.1.1手性化合物 1

1.1.2 手性醇 1

1.1.3 （R）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯的研究进展及意义 2

1.1.4 R-HPBE的合成方法 3

1.2 酮还原酶的研究现状 5

1.2.1 酮还原酶（ketoreductase） 5

1.2.2 酮还原酶的来源 5

1.2.3 酮还原酶催化合成R-HPBE的研究现状 5

1.3本课题的研究内容及意义 6

1.3.1 主要研究内容 6

1.3.2 研究意义 7

2 酶库的扩建 7

2.1 前言 7

2.2 试剂与材料 7

2.3 实验方法 9

2.4 实验结果与讨论 10

2.4.1表达载体的验证 10

2.4.2基因表达 11

2.5 小结 11

3 酶库筛选和候选酶的酶学性质初步研究 11

3.1 引言 11

3.2材料和方法 12

3.2.1酶库中各种酮还原酶基因的表达 12

3.2.2酶库的筛选 12

3.2.3酶活力测定 12

3.2.4酶学性质的研究 13

3.2.5酶底物特异性分析 14

3.3 结果 14

3.3.1酮还原酶酶库的筛选 14

3.3.2 KE1酶学性质的研究 15

3.3.3 KE1酶底物特异性分析 17

4 结论与建议 19

4.1 结论 19

4.2 建议 19

参考文献 20

致谢 22