本研究将通过GmMYB124编码序列分别构入亚细胞定位载体和染色质免疫共沉淀载体，分析GmMYB124蛋白的生理功能。GmMYB124是我们前期通过蛋白质组学分析找到的，与大豆耐盐响应相关的转录因子。盐胁迫是导致大豆减产的主要非生物胁迫之一。MYB是调控植物耐逆境响应的转录因子中报道最多的类型之一。本论文通过从大豆根部克隆出GmMYB124基因的CDS序列；接着进行PCR扩增克隆出目的基因GmMYB124，再将PCR产物连入T载体，送测序。再通过限制性核酸内切酶Mlu Ⅰ和Bgl Ⅱ将目的基因的编码框插入表达载体pDL28-35S pro-RFP中，构建出pDL28-35S pro-GmMYB124-RFP表达载体；通过限制性核酸内切酶Kpn Ⅰ和Spe Ⅰ将目的基因的编码框插入表达载体pDL28-35S pro-DHA-UbqDsRed中，构建出pDL28-35S pro-GmMYB124-DHA-UbqDsRed表达载体。植物表达载体的构建为大豆耐盐品系的分子辅助育种相关研究奠定一定基础。

关键词：大豆；转录因子；载体构建；GmMYB124

目录

引言 4

一、材料及试剂 6

1.1 植物材料 7

1.2 质粒及菌种材料 7

1.3 分子生物化学试剂 7

1.3.1 化学试剂 7

1.3.2 酶与引物 7

二、实验过程 8

2.1 目的基因GmMYB124的获取 8

2.1.1 大豆总RNA的提取 8

2.1.2 逆转录cDNA 9

2.1.3 目的基因GmMYB124的克隆 10

2.2 克隆载体的构建 11

2.2.1 目的基因GmMYB124 DNA片段的回收 11

2.2.2 目的基因GmMYB124连接T载体 11

2.2.3 大肠杆菌感受态的转化 11

2.3 表达载体的构建 12

2.3.1 质粒DNA的提取 12

2.3.2 酶切克隆载体和表达载体 13

2.3.3 T4连接目的基因和表达载体 13

2.3.4 挑取单克隆进行菌液PCR验证 14

2.3.5 提取质粒酶切验证 14

2.4 农杆菌k599转化 15

三、结果与分析 15

3.1 提取总RNA 15

3.2 GmMYB124基因的克隆 15

3.3 T-MYB和载体RFP、DHA酶切 16

3.4 PCR验证 16

3.5 酶切验证 17

3.6 RFP、DHA转农杆菌K599 PCR验证 18

3.7 RFP转农杆菌K599酶切验证 19

四、讨论 19

五、参考文献 20

六、致谢 21