摘    要

 

甾体羟基化合物（(S)-NBHP）是合成依鲁替尼药物的关键中间体，基于依鲁替尼的市场需求量逐年提升，制药企业对依鲁替尼的生产工艺的研究日益重视。依鲁替尼（Imbruvica）是一种新型治疗淋巴瘤的药物，鉴于其独特的药理、药物活性，临床反馈上具有疗效好、不良反应少等众多优点。随着生物催化技术的发展，整合酶催化进行(S)-NBHP 的合成已有可能实现。

本研究利用葡萄糖脱氢酶（GDH）作为再生辅助因子的辅酶，首先筛选出来源于一种海栖热袍菌株Thermotoga maritima（Tm）的嗜热酮还原酶 KRED-43，用于催化还原潜手性化合物甾体酮（NBP）生成(S)-NBHP。应用同源建模以及分子对接的方法构建KRED-43-NADPH-NBP的稳定构象，据此检测可能影响活性的关键氨基酸位点W21；借助定点突变方法获得活性最佳突变体，对底物NBP的相对活性达到121.53%,且ee值>66.72%。

关键词：甾体羟基化合物; 酮还原酶； 半理性突变；

目   录

1 引言 4

1.1 甾体羟基化合物的价值 4

1.2 酮还原酶的研究现状 4

1.3 蛋白定向进化的研究进展 5

1.4 本课题的研究内容及意义 6

2 实验材料及方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌种 7

2.1.2 试剂 7

2.1.3 溶液与培养基 8

2.2 实验仪器 9

2.3 实验方法 9

2.3.1 分子对接及分析 9

2.3.2 突变文库的构建 10

2.3.3 突变酶的活性表达 13

2.3.4 单突变酶的筛选 13

2.3.5 突变体蛋白序列测定 14

3 实验结果与讨论 15

3.1 分子对接 15

3.2 突变文库的构建 15

3.3 突变酶的活性表达 16

3.4 单突变酶的筛选 17

3.5 突变体蛋白序列测定 19

4 小结与展望 19

参考文献 20

致谢 21